2020-12-10
各位小伙伴在做蛋白純化時(shí),是否會(huì)苦惱“誒,我用的填料咋沒用幾次就不行了呢”。在篩選填料時(shí)會(huì)反復(fù)的考察填料壽命。不過,各位小伙伴需要留意了,填料壽命短有可能是你在使用蛋白層析填料時(shí)這些因素沒有考慮周全。
01 重復(fù)裝柱
每次裝柱的過程都涉及到填料的脫氣處理,及裝填柱床時(shí)的壓縮柱床,然后脫氣時(shí)的超聲或者抽濾都會(huì)對(duì)填料施壓,壓縮柱床也要對(duì)填料施壓,反復(fù)的施壓及壓力控制不當(dāng)也會(huì)使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。
柱床被嚴(yán)重污染或者進(jìn)氣泡時(shí),拆裝清洗比CIP效果更好,更有利于填料壽命衰減的降低。
02 樣品狀態(tài)
a.樣品澄清度:樣品越澄清對(duì)填料的壽命衰減影響越小。
b.樣品粘度:樣品的粘度越小,對(duì)填料壽命的影響越小。
c.樣品酸堿度:過酸過堿都會(huì)加速填料壽命的衰減。
d.樣品離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度越高填料壽命衰減的越快。
e.樣品成分組成:樣品成分越復(fù)雜,層析過程越復(fù)雜,填料的壽命衰減越塊(這也與填料所處的工藝階段吻合,捕獲粗純階段填料壽命衰減的更快,精純階段填料壽命衰減的慢。)
03 層析工藝
a.柱床高度,流速及反壓越大,工藝過程填料受到的外力就會(huì)增大,填料的壽命衰減就會(huì)增大。
b.層析工藝過程的緩沖液的種類及洗脫的CV數(shù)也會(huì)影響填料的壽命,緩沖液越溫和對(duì)填料壽命衰減影響越小,洗脫CV數(shù)越小對(duì)填料壽命衰減影響越小。
04 維護(hù)保養(yǎng)
合理的維護(hù)保養(yǎng)過程可以降低填料壽命的衰減,但是維護(hù)過程的CIP及消毒過程通常都需要?jiǎng)×业臈l件,如強(qiáng)酸強(qiáng)堿等,所以CIP的強(qiáng)度及頻率越大對(duì)填料的壽命衰減影響越大。
a.再生:恢復(fù)介質(zhì)原有功能。
b.清洗(CIP):去除填料中積累的雜質(zhì)及污染物,比再生劇烈。
c.消毒:去內(nèi)毒素及微生物。
d.保存:使用后合理保存(溫度,保存液)。
常見的離子交換層析填料清洗
日常清洗
離子交換樹脂每次使用后可以用 1M NaCl 甚至更高離子強(qiáng)度溶液或高 pH 溶液清洗,然后用至少 5 倍柱體積的 Buffer 進(jìn)行平衡至離子強(qiáng)度或 pH 值穩(wěn)定。
CIP(Cleaning In Place)清洗
離子交換樹脂可以重復(fù)使用而無需再生,但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集,往往造成流速和結(jié)合載量都下降,這時(shí)可按照下面方法對(duì)樹脂進(jìn)行清洗。
去除一些沉淀或變性物質(zhì),建議使用下面的方法
用 2 倍柱體積的 1M NaOH 溶液進(jìn)行清洗,然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)
用 3-4 倍柱體積的 70%乙醇或 3-4 倍柱體積的 1% Triton? X-100 清洗,然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。
去除一些離子鍵結(jié)合物質(zhì)
用 3-4 倍柱體積的 2M NaCl 清洗,然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。