各位小伙伴在做方法開發(fā)時(shí)，緩沖鹽是經(jīng)常會使用到的一類試劑，那么小伙伴們對緩沖鹽了解多少呢，我們該如何選擇合適的緩沖鹽呢，這里就讓小編給各位小伙伴們講解一二。

什么時(shí)候需要緩沖鹽？

在反相色譜分析中，流動相的pH值一般在2-7之間，當(dāng)分析物在反相條件下可解離，或樣品的pH值在2－7之外時(shí)，就需要緩沖鹽，在反相條件下可解離的化合物一般有氨基和羧基，他們的pKa在1－11之間，選擇正確的緩沖液pH值可保證解離的官能團(tuán)處于一種形式，離子形式或中性化合物的形式；如果樣品的pH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害，常規(guī)硅膠基質(zhì)色譜柱的pH耐受范圍2-8。

常見緩沖鹽分類

堿類

堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺，兩者都能讓水的pH到達(dá)非常高的水平，高到能把硅膠顆粒溶解掉，要慎用，另外就是這兩種溶劑通常不太容易通過沖洗維護(hù)的方式清除掉。尤其是三乙胺，即使是色譜純，放的久了也可能會由于變質(zhì)導(dǎo)致污染。

酸類

甲酸：通常使用的濃度在1%以下，能夠讓水的pH達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。

乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用濃度不超過5%，能夠使水的pH到達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。

三fu乙酸：比較強(qiáng)的酸，使用濃度通常不超過0.5%，能使水的pH達(dá)到2以下，具有很大的離子強(qiáng)度及一定的離子對作用，是分析蛋白/多肽時(shí)常用的添加劑。以上三種酸更致命的問題在于低波長下的紫外吸收，通常不建議在小于215nm波長的情況下使用，另外就是甲酸/乙酸還有比較大的揮發(fā)性，時(shí)間久了濃度會發(fā)生變化。

磷酸：這是一種不具有揮發(fā)性的酸，離子強(qiáng)度也不錯(cuò)，重要的是，它在低波長紫外區(qū)無本底吸收，但是它也存在不少缺點(diǎn)，比如不能兼容質(zhì)譜方法。

除此之外，還有一些其他的酸，比如硫酸，鹽酸或者檸檬酸，但是都是非常罕見。

鹽類

相比單純的酸堿，根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液，具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值。

甲酸鹽：通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，這類鹽的溶解度好，完全兼容液質(zhì)聯(lián)用的方法，對色譜柱的傷害也比較小，但是缺點(diǎn)是離子強(qiáng)度比較低。另外就是甲酸鹽比較容易潮解，稱量的時(shí)候比較困難，在流動相里還可能揮發(fā)。

與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內(nèi)，只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。

乙酸鹽：常見為乙酸銨。在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強(qiáng)度也不高，與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

磷酸鹽：是HPLC在紫外檢測條件下常用的緩沖液之一，因?yàn)樗梢栽诘陀?20 nm的波長下使用。磷酸鹽具有三個(gè)pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三個(gè)緩沖范圍。雖然它使用廣泛，但是也要注意它的溶解度問題，防止高濃度條件下在HPLC泵或者色譜柱中析出。

常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對pH的控制能力十分接近，只是離子強(qiáng)度稍有差異，絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強(qiáng)度，可惜，磷酸鹽流動相體系無法兼容質(zhì)譜。

以磷酸鈉鹽為例，可以有以下兩種組合的緩沖體系：

磷酸-磷酸二氫鈉：pH可以達(dá)到1.2～3.1左右的范圍。
磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH可以達(dá)到6.5～8左右的范圍。

通過樣品的pka值選擇合適緩沖鹽：

pH 變化會對不同結(jié)構(gòu)化合物的色譜行為產(chǎn)生不同的影響。中性化合物在反相色譜系統(tǒng)的保留與pH 無關(guān)；

酸性化合物在pH 趨于酸性（pH 變小，尤其低于化合物的pka 值）時(shí)會因狀態(tài)趨于中性而增加保留；

堿性化合物在pH 趨于堿性（pH 變大，尤其高于化合物的pka 值）時(shí)會因狀態(tài)趨于中性而增加保留。

反之，高pH 時(shí)酸性化合物保留降低；低pH時(shí)堿性物質(zhì)保留會降低。若想獲得穩(wěn)定的保留，對于酸性待測物而言，流動相的pH 值更好低于待測物pka值兩個(gè)單位；對于堿性待測物來說，流動相的pH值更好高于待測物pka值兩個(gè)單位。