2021-02-22
各位小伙伴在做方法開發(fā)時(shí),緩沖鹽是經(jīng)常會使用到的一類試劑,那么小伙伴們對緩沖鹽了解多少呢,我們該如何選擇合適的緩沖鹽呢,這里就讓小編給各位小伙伴們講解一二。
什么時(shí)候需要緩沖鹽?
在反相色譜分析中,流動相的pH值一般在2-7之間,當(dāng)分析物在反相條件下可解離,或樣品的pH值在2-7之外時(shí),就需要緩沖鹽,在反相條件下可解離的化合物一般有氨基和羧基,他們的pKa在1-11之間,選擇正確的緩沖液pH值可保證解離的官能團(tuán)處于一種形式,離子形式或中性化合物的形式;如果樣品的pH值對柱子有傷害,則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害,常規(guī)硅膠基質(zhì)色譜柱的pH耐受范圍2-8。
常見緩沖鹽分類
堿類
堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺,兩者都能讓水的pH到達(dá)非常高的水平,高到能把硅膠顆粒溶解掉,要慎用,另外就是這兩種溶劑通常不太容易通過沖洗維護(hù)的方式清除掉。尤其是三乙胺,即使是色譜純,放的久了也可能會由于變質(zhì)導(dǎo)致污染。
酸類
甲酸:通常使用的濃度在1%以下,能夠讓水的pH達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。
乙酸:酸性比甲酸略弱,通常使用濃度不超過5%,能夠使水的pH到達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。
三fu乙酸:比較強(qiáng)的酸,使用濃度通常不超過0.5%,能使水的pH達(dá)到2以下,具有很大的離子強(qiáng)度及一定的離子對作用,是分析蛋白/多肽時(shí)常用的添加劑。以上三種酸更致命的問題在于低波長下的紫外吸收,通常不建議在小于215nm波長的情況下使用,另外就是甲酸/乙酸還有比較大的揮發(fā)性,時(shí)間久了濃度會發(fā)生變化。
磷酸:這是一種不具有揮發(fā)性的酸,離子強(qiáng)度也不錯(cuò),重要的是,它在低波長紫外區(qū)無本底吸收,但是它也存在不少缺點(diǎn),比如不能兼容質(zhì)譜方法。
除此之外,還有一些其他的酸,比如硫酸,鹽酸或者檸檬酸,但是都是非常罕見。
鹽類
相比單純的酸堿,根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比,可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液,具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值。
甲酸鹽:通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨,這類鹽的溶解度好,完全兼容液質(zhì)聯(lián)用的方法,對色譜柱的傷害也比較小,但是缺點(diǎn)是離子強(qiáng)度比較低。另外就是甲酸鹽比較容易潮解,稱量的時(shí)候比較困難,在流動相里還可能揮發(fā)。
與甲酸配合,可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系,大概緩沖能力在pH3~4.5的范圍之內(nèi),只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。
乙酸鹽:常見為乙酸銨。在使用上,和甲酸鹽十分類似,離子強(qiáng)度也不高,與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4~5.5左右。
磷酸鹽:是HPLC在紫外檢測條件下常用的緩沖液之一,因?yàn)樗梢栽诘陀?20 nm的波長下使用。磷酸鹽具有三個(gè)pKa值,可提供pH 1.1-3.1,6.2-8.2,11.3-13.3三個(gè)緩沖范圍。雖然它使用廣泛,但是也要注意它的溶解度問題,防止高濃度條件下在HPLC泵或者色譜柱中析出。
常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽,二者對pH的控制能力十分接近,只是離子強(qiáng)度稍有差異,絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的,磷酸由于是多元酸,能夠形成一氫鹽和二氫鹽,所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多,跨度比較大的,并且可以提供較高的離子強(qiáng)度,可惜,磷酸鹽流動相體系無法兼容質(zhì)譜。
以磷酸鈉鹽為例,可以有以下兩種組合的緩沖體系:
磷酸-磷酸二氫鈉:pH可以達(dá)到1.2~3.1左右的范圍。
磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉:pH可以達(dá)到6.5~8左右的范圍。
通過樣品的pka值選擇合適緩沖鹽:
pH 變化會對不同結(jié)構(gòu)化合物的色譜行為產(chǎn)生不同的影響。中性化合物在反相色譜系統(tǒng)的保留與pH 無關(guān);
酸性化合物在pH 趨于酸性(pH 變小,尤其低于化合物的pka 值)時(shí)會因狀態(tài)趨于中性而增加保留;
堿性化合物在pH 趨于堿性(pH 變大,尤其高于化合物的pka 值)時(shí)會因狀態(tài)趨于中性而增加保留。
反之,高pH 時(shí)酸性化合物保留降低;低pH時(shí)堿性物質(zhì)保留會降低。若想獲得穩(wěn)定的保留,對于酸性待測物而言,流動相的pH 值更好低于待測物pka值兩個(gè)單位;對于堿性待測物來說,流動相的pH值更好高于待測物pka值兩個(gè)單位。