2021-12-28
今天,小編繼續(xù)給大家?guī)?lái)液相色譜你問(wèn)我答第五彈~
1 那怎么才能避免拖尾呢?
答:首先我們需要找到產(chǎn)生拖尾的原因,拖尾通常由以下幾個(gè)原因造成:柱外接口體積擴(kuò)大、柱床污染以及被分析物與鍵合活性位點(diǎn)相互作用而產(chǎn)生的,這就需要根據(jù)不同原因來(lái)分別對(duì)待處理。
2 怎么檢查拖尾的原因?
答:首先要仔細(xì)觀察色譜圖,在不知道樣品性質(zhì)和色譜條件的情況下,色譜圖可以提供很多線索,再借助其余的條件來(lái)驗(yàn)證基于色譜圖的猜想。di一檢查峰高,觀察色譜柱是不是在此色譜條件下過(guò)載了,為了確認(rèn)是否真的過(guò)載,可以再進(jìn)1/10 濃度的樣品看看峰型是否有改善。如果低濃度下依然拖尾,再觀察色譜圖,如果色譜中有很多峰,看各個(gè)峰型是保持一定的拖尾程度還是隨著時(shí)間推移峰型有一致的變化趨勢(shì),如果圖譜中前邊的峰比后邊的峰拖尾的更厲害,可以考慮柱外效應(yīng)的影響。如果色譜圖中所有峰的拖尾程度一致,那么有兩個(gè)可能:1)柱床損壞,2)是圖譜中所有樣品組分化學(xué)結(jié)構(gòu)類似,拖尾是因化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的。
3 哪些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生這些化學(xué)效應(yīng),能說(shuō)明下嗎?怎么解決?
答:化學(xué)效應(yīng)有好幾種,更常見(jiàn)的就是分析物與不均一的活性表面的相互作用。典型的就是堿性化合物在反相柱中的拖尾,通常帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性或堿性基團(tuán)的化合物能與填料表面殘留的硅羥基和鍵合相發(fā)生次級(jí)吸附作用,進(jìn)而產(chǎn)生拖尾。
解決途徑:
1)分析堿性化合物可以在流動(dòng)相中添加三乙胺(TEA)作為減尾劑,TEA與堿性化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合硅羥基,用于消除分析物與殘留硅羥基間的相互作用。
2)酸性化合物拖尾則需要降低流動(dòng)相的pH值,盡量使酸質(zhì)子化,可以通過(guò)向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)的有機(jī)酸,如使用0.1%三氟乙酸 (TFA) 得到了比較好的結(jié)果,并且這種添加劑具有比較低的紫外截止波長(zhǎng)。
3)提高流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度,抑制離子作用。
4)在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑,反相流動(dòng)相中一般加入0.003-0.01mol/L的離子對(duì)試劑,改善峰型和增加化合物保留。
5)選擇高純硅膠色譜柱和徹底封端柱,例如:月旭Ultimate? Polar-RP,Xtimate? C18 等。
4 但我在有些色譜圖中,會(huì)看到色譜峰前沿,是什么會(huì)導(dǎo)致前沿呢?
答:首先我們也需要找到前沿的原因,前沿通常有以下幾個(gè)原因:柱外體積、柱床污染以及溶劑效應(yīng)。這就需要我們通過(guò)觀察色譜圖來(lái)查找原因進(jìn)而解決問(wèn)題。當(dāng)然過(guò)載的情況,我們也是通過(guò)降低樣品濃度來(lái)驗(yàn)證,如果低濃度依然前沿,再觀察色譜圖,如果色譜中有很多峰,所有峰,看各個(gè)峰型是保持一定的前沿程度還是隨時(shí)間前沿峰型有一致的變化趨勢(shì),如果圖譜中前邊的峰比后邊的峰前沿更厲害,可以考慮柱外效應(yīng)或溶劑效應(yīng)的影響。如果色譜圖中所有峰的前沿程度一致,那么可能是柱床損壞或圖譜中的樣品物質(zhì)性質(zhì)導(dǎo)致。
5 怎么解決峰前沿呢?
答:1)溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的峰前沿,在反相LC中,如使用1OO%有機(jī)溶劑或1OO%強(qiáng)溶劑,大體積進(jìn)樣時(shí),將使色譜峰過(guò)早洗脫出色譜柱,導(dǎo)致峰變形,可以用峰形前沿抑制器來(lái)避免這個(gè)問(wèn)題。在液相色譜中用溶于流動(dòng)相的小體積進(jìn)樣更為理想?;蛘哂昧鲃?dòng)相或與流動(dòng)相極性差不多的溶劑溶解樣品,如果一定要使用強(qiáng)溶劑溶解,那需要減少進(jìn)樣體積。
2)柱外效應(yīng)導(dǎo)致的峰前沿,我們需要減少儀器系統(tǒng)的死體積,進(jìn)而解決前沿現(xiàn)象。
3)對(duì)于樣品性質(zhì)導(dǎo)致的峰前沿,可以考慮增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度,而增加流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度,減少因靜電的作用引起的前沿,或者在流動(dòng)相中加適量的四氫呋喃(通常加入的量在5%內(nèi)即可),當(dāng)然升高柱溫也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。
4)色譜柱渦流
填料產(chǎn)生的空隙使流動(dòng)相及溶質(zhì)的流速比平均流速移動(dòng)更快,從而導(dǎo)致峰拖尾或前伸??障懂a(chǎn)生的原因是填充不當(dāng),或填充柱床塌陷。
5)假前沿
兩個(gè)物質(zhì)未分離開(kāi),但出現(xiàn)一定的分離趨勢(shì)。
峰前沿案例分析:C18,流動(dòng)相是水-甲醇(55:45),做出來(lái)的對(duì)照品和樣品峰都前延?
1)樣品是否過(guò)載。降低進(jìn)樣濃度,看峰形是否有所改善。一般認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適,不至于因過(guò)載影響峰形。
2) 檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣品。溶解樣品的溶劑(如純甲醇)洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)會(huì)發(fā)生峰前延。具體機(jī)理是:正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的,濃度分布在整個(gè)通過(guò)色譜柱柱床的過(guò)程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進(jìn)樣后到達(dá)色譜柱時(shí)間很短,應(yīng)還未被流動(dòng)相充分稀釋,洗脫能力更強(qiáng)的樣品溶劑的局部存在,將使部分樣品被洗脫的速度加快,導(dǎo)致峰前延。
3)增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度。增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度,減少因靜電的作用(有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間)引起的前延。
4)流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃。往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃有時(shí)可以改善峰形、增大分離度,很多色譜工作者都知道和使用,但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以內(nèi)即可,需要的時(shí)候可以加入更大的量。
6 液相色譜柱應(yīng)該如何活化?
答:對(duì)于液相色譜柱而言,每根色譜柱在裝運(yùn)之前都經(jīng)過(guò)了測(cè)試,并存放在測(cè)試洗脫液中進(jìn)行運(yùn)輸。因此,在shou次使用時(shí),反相柱建議80%的甲醇使用檢測(cè)樣品1/2的流速?zèng)_洗4小時(shí),再用流動(dòng)相徹底地平衡色譜柱即可進(jìn)樣分析。如果使用流動(dòng)相添加劑(如緩沖液或離子對(duì)試劑),建議使用含原有比例但不含這些添加劑的流動(dòng)相進(jìn)行中間過(guò)渡10至20個(gè)色譜柱體積再更換成分析樣品流動(dòng)相。對(duì)于具有較短化學(xué)鏈(例如C8、苯基、CN)鍵合相的色譜柱,應(yīng)小心確保在使用色譜柱之前對(duì)其進(jìn)行徹底的平衡。這樣可確保重復(fù)性,并有助于防止保留時(shí)間的漂移。
正相溶劑和反相溶劑是不互溶的,這一點(diǎn)不能忽略。對(duì)于新購(gòu)柱子,首先請(qǐng)注意打開(kāi)分析測(cè)試說(shuō)明書(shū),了解柱子的保存溶劑。如果保存溶劑與你將要使用的流動(dòng)相不互溶,請(qǐng)先用異丙醇過(guò)渡。過(guò)渡過(guò)程中注意因異丙醇粘度較大,會(huì)導(dǎo)致柱壓升高,適當(dāng)調(diào)低流速。如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽類,先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過(guò)渡,避免緩沖鹽的析出。
7 我在使用氨基柱分析糖類物質(zhì)時(shí),為什么目標(biāo)物的保留時(shí)間會(huì)不穩(wěn)定,逐漸前移呢?
答:這是由氨基柱的特性造成的,因?yàn)榘被诜治鎏穷悤r(shí),典型的流動(dòng)相是60%~90%的乙腈水混合液,當(dāng)在使用過(guò)程中,填料空隙處高濃度的氨基基團(tuán)顯堿性,導(dǎo)致硅膠和鍵合相緩慢的水解,隨著時(shí)間的推移,脫落的鍵合相越來(lái)越多,就會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的保留時(shí)間發(fā)生變化,同時(shí)這也是氨基柱在反相條件下壽命變短的原因。
8 色譜柱壓力高
答:色譜柱壓力升高是液相工作者們?cè)趯?shí)際應(yīng)用過(guò)程中較為常見(jiàn)的問(wèn)題,首先考慮“堵”。壓力升高的主要原因總結(jié)為以下幾點(diǎn):
1. 色譜柱入口篩板堵塞;
2. 樣品或流動(dòng)相緩沖鹽在色譜柱內(nèi)析出;
3. 色譜柱污染;
4. 流動(dòng)相粘度過(guò)高;
5. 在線過(guò)濾器或者保護(hù)柱堵塞;
6. 管線堵塞;
7. 聚合物色譜柱:溶劑改變導(dǎo)致溶脹。
解決途徑:
1.用標(biāo)準(zhǔn)流速的1/4流速反沖色譜柱,不接檢測(cè)器,去除篩板堵塞物。(除1.8μm粒徑色譜柱外)
2.盡量選用流動(dòng)相做樣品溶劑,減少樣品析出的可能。盡可能降低流動(dòng)相中鹽的濃度。使用帶鹽的流動(dòng)相后,應(yīng)使用與流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗色譜柱10到20柱體積,再保存在適宜的溶劑中。
3.色譜柱污染,需要對(duì)色譜柱清洗再生。
4.盡量選擇粘度小的溶劑做流動(dòng)相,或者升高柱溫。
5.檢查在線過(guò)濾器濾頭以及保護(hù)柱柱芯,必要時(shí)更換。
6.拆卸管線以便確證,必要時(shí)更換。
7.對(duì)于聚合物基質(zhì)的色譜柱,需要了解溶劑兼容性信息。
9 色譜柱壓力低?
答:色譜柱壓力降低,首先考慮“漏”。壓力升低的主要原因總結(jié)為以下幾點(diǎn):
1. 溶劑進(jìn)口過(guò)濾芯堵塞;
2. 連接管路泄漏或其他備件(泵頭密封墊);
3. 溶劑或流速改變;
4. 泵入口閥失靈;
5. 泵出口閥失靈;
6. 色譜柱失效,固定相流失。
解決途徑:
1、檢查各管路及密封墊等備件;
2、更換色譜柱;
3、檢查色譜條件是否改變;
4、檢查泵流量準(zhǔn)確。
10 液相的死體積和延遲體積?
答:1)死體積
指的是有效進(jìn)樣點(diǎn)到有效檢測(cè)點(diǎn)之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括4部分:進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動(dòng)相占據(jù),Vm)、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程,其他 3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展,這3部分體積應(yīng)盡量減小。
2)延遲體積
延遲體積指的是溶劑混合點(diǎn)(通常在液相色譜儀的混合腔內(nèi)或比例閥中)與LC柱頭之間的體積。