不同色譜柱和不同批次之間的重現(xiàn)性

 問(wèn)：我要開(kāi)始開(kāi)發(fā)一個(gè)新的HPLC方法。驗(yàn)證之后，該方法將轉(zhuǎn)道QC實(shí)驗(yàn)室并將使用許多年。我擔(dān)心該方法的長(zhǎng)期的重復(fù)性，特別是柱子的長(zhǎng)期重復(fù)性。怎樣才能確保好的重復(fù)性呢？

答：首先，我要表?yè)P(yáng)你在開(kāi)始做這個(gè)方法的時(shí)候就能考慮到這個(gè)方面。如果可以預(yù)料到該方法將要使用好幾年，在選擇柱子方面就要做些功課。要想使柱子在該方法的可預(yù)見(jiàn)的適用期內(nèi)使用，就要選擇一些大的生產(chǎn)廠家。另外，要選擇一種標(biāo)準(zhǔn)的表面化學(xué)物質(zhì)（比如C18或C8）而不是那些新奇的或很少使用的。

下一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)才是柱子的重復(fù)性，如果你或你的同事以前用過(guò)一根柱子有很好的重復(fù)性，這是一個(gè)很好的起點(diǎn)，同時(shí)也要考慮生產(chǎn)商提供的信息。近來(lái)有的廠家開(kāi)始印刷他們的說(shuō)明和不同批次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。你可以從廠家得到這些信息然后細(xì)心對(duì)照。

 問(wèn)：我該從這些信息中尋找什么呢？

答：我們先來(lái)解釋一下不同柱子和批次之間重復(fù)性的不同方面。下面就說(shuō)一下反相填料，因?yàn)樗麄兏悠毡椤?/span>

如果你用同一批填料的不同柱子，將會(huì)得到不同的塔板數(shù)（峰寬），不同的柱壓，不同的保留時(shí)間。保留時(shí)間與填料密度和柱體積呈比例改變，而柱體積則取決于柱子的內(nèi)徑。這個(gè)改變對(duì)你的方法應(yīng)該是沒(méi)什么影響的，因?yàn)樗蟹宓谋Ａ魰r(shí)間都呈比例的改變，而分離度還是沒(méi)變。這個(gè)原因?qū)е碌谋Ａ魰r(shí)間變化的RSD通常在3%左右，但是如果生產(chǎn)商對(duì)柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子塔板數(shù)的變化會(huì)影響方法，特別是做雙峰的時(shí)候，它們很少能達(dá)到基線分離的。盡管2-3%的塔板數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差已經(jīng)可以達(dá)到，但通常還是在±10%，記住塔板數(shù)是個(gè)平方數(shù)，分離度僅僅取決于塔板數(shù)的根。所以塔板數(shù)2%的偏差相當(dāng)于峰寬1%的偏差。你要確認(rèn)一下柱子的廠家是有塔板數(shù)的上下限，還是只有一個(gè)下限，上下限都有比較讓人滿意。

同一裝填程序的柱子其柱壓的重復(fù)性是相當(dāng)好的，同一批次變化應(yīng)不超過(guò)±5%。 

 問(wèn)：那么批次之間的重復(fù)性怎么樣呢？

答：如果你注意一下批次間的色譜參數(shù)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)同參數(shù)會(huì)不同，更重要的是批次間分離的選擇性也會(huì)改變。就是說(shuō)峰的相對(duì)保留會(huì)改變，比如他們?cè)谏V圖中的相對(duì)位置，這對(duì)你方法的確定性是不利的。

這種改變是你要盡量避免的，所以你要從廠家那里得到一些消息，他們是怎么確保批次之間重復(fù)性的，這包括一些物理，化學(xué)，色譜方面的測(cè)試。在物理測(cè)試中，更重要的一項(xiàng)是裝填的表面積，該項(xiàng)參數(shù)的變化會(huì)直接導(dǎo)致保留時(shí)間的變化。所以你要知道廠家認(rèn)可的批次間表面積改變的幅度是多少。通常情況下幅度是±10%，但是±5%也是可以達(dá)到的。化學(xué)方面的參數(shù)更重要的是鍵合相的表面覆蓋率。通常用多少μmol/m² 表示。許多廠家并沒(méi)有直接給出這個(gè)參數(shù)，而只說(shuō)明了C的百分含量。我們希望看到的這個(gè)代替性的說(shuō)明以及一個(gè)緊湊的幅度，通常是±10%，低于±4%的也可以達(dá)到。

更后你要知道廠家的色譜重復(fù)性測(cè)試，通常色譜柱會(huì)附帶一張色譜圖，檢測(cè)的是一些簡(jiǎn)單的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是這不是一個(gè)好的批次間重復(fù)性測(cè)試。因?yàn)檫@些中性疏水化合物的相對(duì)保留重復(fù)性相當(dāng)好，對(duì)裝填中表面覆蓋率的改變是相當(dāng)不敏感的。好的批次間重復(fù)性測(cè)試還應(yīng)在混合物中添加強(qiáng)堿化合物。在精心設(shè)計(jì)的測(cè)試中，精選的堿性化合物主要與殘余硅羥基作用，而中性化合物則主要與鍵合相作用。只有含有2種化合物的重復(fù)性測(cè)試才是讓人信服的。如果一個(gè)廠家是這樣測(cè)試的并且有好的重復(fù)性，那么他的柱子會(huì)更加讓人放心。 

 問(wèn)：我不知道廠家的測(cè)試與我的化合物的檢測(cè)有什么聯(lián)系，我應(yīng)該怎樣在我的檢測(cè)中確保一個(gè)好的批次間重復(fù)性呢？

答：你說(shuō)的很對(duì)，上面的消息只能讓你有一個(gè)比較大的機(jī)會(huì)確保重復(fù)性。但更后必須用你自己的檢測(cè)來(lái)做重復(fù)性測(cè)試。有些廠家提供一整套的設(shè)備包括不同裝填批次的柱子來(lái)做這個(gè)測(cè)試，另外有的廠家則按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的東西。同一裝填批次的色譜柱是沒(méi)有用的，你需要的是用不同鍵合反應(yīng)裝填的柱子。如果同一批次是不同天內(nèi)裝填，然后色譜柱編號(hào)又不同的時(shí)候的時(shí)候，你更好詢(xún)問(wèn)2次，確保廠家給你的是你要的。

你需要3根不同批次的色譜柱來(lái)為你的方法做重復(fù)性測(cè)試。如果批次間的改變不影響你的檢測(cè)，那么接下來(lái)的時(shí)間你的方法應(yīng)該有一個(gè)好的重復(fù)性。