2022-03-09
在離子交換過程中保持pH的恒定是十分重要的,正如前面討論過的,pH的改變會造成蛋白質(zhì)帶電荷數(shù)量和分布狀況發(fā)生變化,從而直接影響到蛋白質(zhì)是否能結合在交換劑上以及結合力的強弱。因此,在離子交換色譜中流動相必須使用緩沖液。
緩沖液的種類很多,能夠起緩沖作用的物質(zhì)可分為兩類:di一類是由弱酸(或弱堿)及相應的鹽構成的系統(tǒng);第二類是兼性離子化合物。對于di一類緩沖物質(zhì),在進行離子交換時,如果緩沖離子所帶的電荷與離子交換劑上的功能基團相反,將參與離子交換過程,并可能對局部pH產(chǎn)生影響,因此應盡可能采用與功能基團帶同種電荷的緩沖離子,即:使用陰離子交換劑時選擇帶正電荷的緩沖離子;使用陽離子交換劑時選擇帶負電荷的緩沖離子。
當然這也并不是jue對的,比如磷酸鹽緩沖液也經(jīng)常在陰離子交換過程中被采用,但在這種情況下應特別注意在上樣前充分平衡,確保色譜系統(tǒng)的pH和離子強度與起始緩沖液一致。第二類緩沖物質(zhì)在陰、陽離子交換中均能采用。表1和表2分別列出了陽離子交換色譜和陰離子交換色譜時常用的緩沖液。
在離子交換過程中雖然可以除去很多雜蛋白,起到純化效果,但目的蛋白的洗脫峰中必然含有大量緩沖物質(zhì)和鹽的成分,這些成分的引入對于目的蛋白來說本身也是一種雜質(zhì)。特別在色譜后需對洗脫峰進行冷凍干燥,以得到純蛋白樣品時,在凍干后的粉末中往往絕大部分是緩沖物質(zhì)和鹽。如果在凍干前進行脫鹽或透析操作,雖然可以基本除去這些雜質(zhì),但也有可能造成蛋白活性的回收率下降。此時應優(yōu)先考慮采用揮發(fā)性的緩沖物質(zhì),這樣在凍干階段可以將這部分雜質(zhì)除去,常見的揮發(fā)性緩沖物質(zhì)列于表3。
? Q /SP/DEAE/CM Tanrose FF
快流速瓊脂糖基架離子交換介質(zhì)
? Q/SP Tanrose HP
高分辨率瓊脂糖基架離子交換介質(zhì)
? Q/SP Tanrose XL
高載量瓊脂糖基架離子交換介質(zhì)
? Q/SP Tanrose BB
大顆粒瓊脂糖基架離子交換介質(zhì)
? DEAE/CM Tandex
葡聚糖基架離子交換介質(zhì)