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月旭Welchrom ProCot G-25 預(yù)裝柱的使用方法

2022-06-23

G-25葡聚糖凝膠填料，采用分子篩原理根據(jù)分子大小的不同來(lái)分離目標(biāo)蛋白。具有分辨率高、易收集、耐酸堿耐高溫等特點(diǎn)，且具有良好的穩(wěn)定性，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)脫鹽。

如下，以IgG蛋白純化的脫鹽為例細(xì)說(shuō)月旭Welchrom^? ProCot G-25（5mL）預(yù)裝柱的使用方法：

溶液配制

a.蛋白溶液1（含檸檬酸鈉鹽）：Protein G 4FF親和柱純化IgG蛋白洗脫液。

b.平衡液1（20mM PB，pH7.0）：取100mL 0.2M PB（A液：B液=31:69）加水稀釋至1000mL。

A液（0.2M磷酸二氫鈉水溶液）：稱(chēng)取NaH₂PO₄?H₂O 27.6g溶于超純水中，稀釋至1L抽濾保存。

B液（0.2M磷酸氫二鈉水溶液）：稱(chēng)取Na₂HPO₄?7H₂O 53.6g (或Na₂HPO₄?12H₂O 71.6g或Na₂HPO₄?2H₂O 35.6g ) 加蒸餾水溶解，加水至1L。

c.平衡液2（150mM NaCl，20mM PB，pH7.0）：稱(chēng)取8.766g NaCl，溶解于20mM PB中，調(diào)pH至7.0，定容至1L過(guò)水相濾膜抽濾。

d.柱清洗液1（0.5M NaOH）：稱(chēng)取20g NaOH加超純水溶解至1L。

e.柱清洗液2（10%乙腈）：量取100mL經(jīng)有機(jī)濾膜抽濾好的乙腈，加超純水定容至1L。

f.保存液（20%乙醇）：取200mL無(wú)水乙醇加超純水稀釋至1L。

實(shí)驗(yàn)步驟

a.平衡：20mM PB（pH7.0）平衡后再用超純水平衡至基線(xiàn)穩(wěn)定

b.上樣：取1mL樣品溶液，通過(guò)A1管路上樣，流速0.5mL/min，待到檢測(cè)器顯示UV值出峰時(shí)開(kāi)始收集，收集到峰值下降，電導(dǎo)值急劇增加的節(jié)點(diǎn)為①號(hào)管，而后收集至出峰結(jié)束為②號(hào)管。

c.柱清洗：用0.5M NaOH進(jìn)行柱清洗。

d.脫鹽效果色譜檢測(cè)：收集脫鹽前后樣品進(jìn)行色譜檢測(cè)，評(píng)價(jià)脫鹽效果。

過(guò)柱純化

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表1 月旭Welchrom^? PreCot G-25F純化參數(shù)

SEC-300色譜檢測(cè)

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表2 月旭 Xtimate^? SEC-300色譜柱檢測(cè)參數(shù)

譜圖和數(shù)據(jù)

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圖1 G-25收集方法分離純化譜圖

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圖2 G-25收集方法①號(hào)管收集

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圖3 G-25收集方法②號(hào)管收集

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結(jié)果分析：①號(hào)管中的蛋白脫鹽率達(dá)到97%，②號(hào)管中大部分為雜質(zhì)鹽，僅有少部分目標(biāo)蛋白。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

月旭Welchrom^? PreCot G-25F（5mL，00051-33012）更適的收集方法為：從UV值出峰時(shí)開(kāi)始收集，將蛋白峰值下降且電導(dǎo)值急劇增加至20以下作為收集節(jié)點(diǎn)，可以達(dá)到良好的脫鹽效果。再生使用脫鹽效果穩(wěn)定，脫鹽率保持在95%以上，PreCot G-25F預(yù)裝柱的更大脫鹽量為1mL可溶鹽溶液。