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2022-07-20
凝膠過(guò)濾層析是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒的分子篩作用,根據(jù)被分離樣品中各組分分子量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項(xiàng)技術(shù)。今天主要為大家介紹一下凝膠過(guò)濾層析中的一些重要參數(shù)。
一、凝膠的參數(shù)
#1 凝膠顆粒大小
顆粒的大小通常用目(mesh)或直徑 (μm)來(lái)表示。色譜分離用的凝膠一般都制成球形顆粒。凝膠顆粒的大小直接關(guān)系到色譜柱的流速和分辨率,顆粒越大,流速越快,但分辨率較差;相反,顆粒越小,流速越慢,但分辨率提高。
#2 排阻極限
指不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部孔隙的更小分子的分子量。排阻極限反應(yīng)某種凝膠能有效分離的更大分子量,所有大于排阻極限的分子均被完全排阻,不能分離。如Tandex G25的排阻極限為5000Da,它表明分子量大于5000Da的分子為全排阻。
#3 分級(jí)范圍 (或工作范圍)
所能進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔隙的更大分子和更小分子的分子量范圍。它表示一種凝膠適用的分離范圍,如Tandex G25對(duì)球形蛋白的分級(jí)分離范圍為1000-5000Da,它表示通過(guò)Tandex G25可有效分離分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的球形蛋白。
#4 吸水量1g干膠吸收水的體積或質(zhì)量。凝膠型號(hào)越大,吸水量越大。
#5 床體積1g干膠吸水后的更終體積。
二、體積參數(shù)
#1 外水體積
柱內(nèi)凝膠顆粒之間的空隙體積的總和,用Vo表示。
#2 基質(zhì)體積
干膠溶脹后顆粒本身所固有的體積,用Vg表示。
#3 內(nèi)水體積
凝膠顆粒內(nèi)部孔隙體積的總和,或者為小分子溶質(zhì)可滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部體積的總和,又稱(chēng)固定相體積,用Vi表示。
#4 柱床體積
凝膠柱裝成后從柱底板到凝膠沉積層表面的總體積,又稱(chēng)床體積,用Vt表示。
其計(jì)算公式為:
由于Vg相對(duì)較小,可忽略不計(jì),故有:
#5 洗脫體積
某一被分離樣品從凝膠柱內(nèi)完全被洗脫出來(lái)時(shí)所需洗脫液的體積,用Ve表示。
其計(jì)算公式為:
式中,Kd是分配系數(shù);Ve一般介于Vo和Vo+Vi之間。對(duì)于完全排阻的大分子,由于其不進(jìn)入凝膠內(nèi)部,只能在顆粒間隙中流動(dòng),故其洗脫體積Ve=Vo;而對(duì)于完全滲透的小分子,由于它可在整個(gè)凝膠柱內(nèi)流動(dòng)(忽略Vg),故其洗脫體積Ve=Vo+Vi;分子量介于兩者之間的分子,它們的洗脫體積也介于兩者之間;一些吸附蛋白在更后洗出。
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