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提示

一山怎能容二虎?

2022-08-23

俗話說(shuō)的好,一山怎能容二虎?在我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)時(shí),這個(gè)道理也同樣適用。有實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的小伙伴都知道,在HPLC分析中,如果色譜柱性能正常,樣品濃度適宜,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下,峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳,如下圖1所示。 

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但在實(shí)際操作中,如果對(duì)樣品不了解,前處理不恰當(dāng)或者分析方法不合理等,會(huì)出現(xiàn)峰形不正常的情況,其中雙峰現(xiàn)象就是液相色譜中常見(jiàn)的問(wèn)題之一,如下圖2所示。色譜雙峰指的是明明是同一種物質(zhì),但在色譜圖中卻呈現(xiàn)雙峰,讓實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為含有兩種物質(zhì),從而影響判斷。

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一般出現(xiàn)色譜雙峰的時(shí)候,

我們可以從以下幾種原因排查

1、接頭連接不正確

●如果色譜柱在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)每個(gè)峰的峰形都出現(xiàn)問(wèn)題,先考察是否有連接問(wèn)題。管線可能太長(zhǎng)或太短,這種情況可能導(dǎo)致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長(zhǎng),密封圈位置不當(dāng),將發(fā)生滲漏。如果管線推出的距離不夠,將會(huì)產(chǎn)生一段死空間,形成混合腔,導(dǎo)致柱外體積,使峰形變壞。

2、色譜柱

●如果在樣品分析時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都有雙峰出現(xiàn),尤其在采用單一純物質(zhì)時(shí),所有的接頭都是正常連接,則可以確定是色譜柱出現(xiàn)問(wèn)題了,一般是柱頭受損或者柱頭固定相污染引起的。

如果進(jìn)樣量少,原來(lái)色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過(guò)來(lái)接,用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過(guò)來(lái),一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖,正沖有時(shí)也會(huì)正常的。

如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,建議按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行日?;虍惓5脑偕鷽_洗。如果沖洗無(wú)法改善出峰情況,建議聯(lián)系色譜柱廠商進(jìn)行排查或維修。

3、保護(hù)柱失效

●如果樣品基質(zhì)比較臟,使用一段時(shí)間之后,發(fā)現(xiàn)的峰分叉或拖尾等問(wèn)題,很有可能是保護(hù)柱失效造成的。一般粗略判斷標(biāo)準(zhǔn),塔板數(shù)、壓力或分離度的改變超過(guò)10%,就需要更換保護(hù)柱了。保護(hù)柱是消耗品,建議直接更換,不需要再生。 

4、進(jìn)樣量

●當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主時(shí),如果樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20μL,此時(shí)單一的純物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)雙峰,第二峰比di一峰?。看味疾惶粯?span style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; font-family: mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, "Helvetica Neue", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei UI", "Microsoft YaHei", Arial, sans-serif; letter-spacing: 1.6px; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">),且拖尾,保留時(shí)間會(huì)提前相對(duì)進(jìn)樣量少而言,將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大,而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的溶劑效應(yīng)問(wèn)題,該情況的異常建議用流動(dòng)相作為稀釋劑或減少進(jìn)樣量以消除溶劑效應(yīng)。

另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但jue對(duì)量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問(wèn)題。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過(guò)大,色譜柱過(guò)載造成的。

5、溶劑問(wèn)題

●目前HPLC分析多為反相色譜,流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解,更佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解。在實(shí)際分析中,有時(shí)候?yàn)榱藰悠返娜芙庑曰蚍€(wěn)定性加入了一點(diǎn)的緩沖液,緩沖液的酸堿性可能會(huì)導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)化,從而產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象。此時(shí)需要更換緩沖液,調(diào)整溶劑pH值,或者用流動(dòng)相配置樣品。

此外,樣品要現(xiàn)配現(xiàn)用,避免樣品溶解液的有機(jī)相比例、pH值發(fā)生變化而導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)。

6、樣品特性

●有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無(wú)法分開(kāi),而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下(如pH值、流動(dòng)相極性、溫度等,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失。

7、pH值

●體系pH值對(duì)色譜雙峰的影響出現(xiàn)在各個(gè)環(huán)節(jié)上(前面已經(jīng)提到,尤其在緩沖液流動(dòng)相平衡過(guò)程中其影響更為明顯。當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí),受pH的連續(xù)變化影響會(huì)經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。另外,在樣品分析時(shí),流動(dòng)相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點(diǎn),否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對(duì)試劑分析時(shí),選擇不好條件也會(huì)容易引起雙峰的產(chǎn)生。

如果以上幾方面均無(wú)法幫您排除色譜實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)雙頭峰的問(wèn)題,您可以聯(lián)系月旭科技售后技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)。

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