2022-09-29
01 多肽的性質(zhì)
多肽由多個氨基酸依次連接而成的化合物,氨基酸是兩性化合物,具有兩性離子的特性。 02 影響多肽分離的因素 1、色譜柱填料孔徑(120?、300?) 2、添加劑及濃度(甲酸、離子對試劑) 3、pH 4、洗脫溶劑(乙腈、甲醇、異丙醇) 5、梯度 6、溫度 7、流速 孔徑是指硅膠球上小孔的直徑。分子進入小孔,在小孔內(nèi)被鍵合的烷基吸附,達到分離的效果??讖叫。茁矢?,比表面積大,載碳量高。分子在孔內(nèi)分離,孔徑大小必須和分子大小相匹配,分子必須能進入孔內(nèi),一般小分子使用80-120?,大分子通常使用300?,為了達到更佳分離,一般要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上。 低pH減少了酸性側(cè)鏈的解離,離子對試劑(比如三氟乙酸)與肽鏈堿性側(cè)鏈作用,中和其電性,電荷的減少使多肽的疏水作用增強,堿性多肽側(cè)鏈與硅醇基無法產(chǎn)生吸附,但離子對試劑會使得MS的離子化效率降低。
03 項目案例 液相上的分離: 色譜柱:月旭UItimate? XB-C18(2.1×100mm,5μm 300?)。 流動相:梯度 A(0.1%三氟乙酸) B(0.1%甲酸乙腈); 柱溫:40℃; 紫外檢測器:220nm; 流速:0.3mL/min; 進樣量:5μL。 討論: 多肽化合物分子量大約為2000,選擇120?孔徑和300?孔徑均可以達到有效保留,在實驗過程中發(fā)現(xiàn)120?的峰形差,分析可能是該物質(zhì)在這個體系中的分子體積較大,故在300?的柱子上峰形有了明顯的改善??梢姺肿恿靠梢杂糜谶x擇填料孔徑的參考,但不是jue對的,做多肽時建議常規(guī)孔徑120?和大孔徑300?的色譜柱都做一下嘗試,選擇更合適的孔徑; 流動相中使用甲酸為添加劑時沒有保留,選擇具有離子對作用的三氟乙酸時保留良好,該體系是檢測多肽時的常規(guī)shou選體系,再根據(jù)該體系下的結(jié)果進行調(diào)整。