02 流動(dòng)相優(yōu)化及測(cè)試結(jié)果圖譜

2.1 初步嘗試流動(dòng)相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀，PH=4.60。

結(jié)果：化合物3保留時(shí)間2.6min，化合物1不出峰。估計(jì)是化合物1保留太強(qiáng)未洗脫下來(lái)。接下來(lái)，調(diào)整pH并增加有機(jī)相的比例，來(lái)加大洗脫能力。

2.2 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：甲醇=60：40。

混合對(duì)照?qǐng)D譜如下：

實(shí)驗(yàn)中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉，增加有機(jī)相（甲醇）比例，結(jié)果三個(gè)物質(zhì)分離良好，但是化合物1（19.9分鐘）峰型太差，下一步優(yōu)化化合物1的峰型。

2.3 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：乙腈=80：20。

化合物1圖譜：

基于上一次實(shí)驗(yàn)，將有機(jī)相甲醇變?yōu)橐译?，通過(guò)改變選擇性看是否峰型會(huì)有改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有任何改善，而且發(fā)現(xiàn)這個(gè)方法中有機(jī)相只提供洗脫能力，不提供選擇性改變作用。

2.4 流動(dòng)相：緩沖液（緩沖液：1.00g十二烷基磺酸鈉，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調(diào)pH=1.80）：甲醇=60：40。

混合對(duì)照?qǐng)D譜：

當(dāng)時(shí)換成這個(gè)流動(dòng)相的主要思路是，加十二烷基磺酸鈉使保留更強(qiáng)，加氯化銨提高離子濃度，調(diào)pH至1.80強(qiáng)酸性使化合物1中-NH₂官能團(tuán)作用更弱，達(dá)到優(yōu)化峰型的目的，但是效果很差?；仡^總結(jié)發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質(zhì)的不同官能團(tuán)上，導(dǎo)致越走越偏離分離的軌跡，這里，三個(gè)物質(zhì)共同含有的官能團(tuán)可能也是影響分離的主要因素，換了個(gè)角度后，豁然開(kāi)朗了。推翻了之前的方案，將離子對(duì)試劑換為四丁基氫氧化銨，從頭開(kāi)始。

2.5 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=9.30）：乙腈=80：20。

混合對(duì)照?qǐng)D譜：

流動(dòng)相中添加三乙胺和并將pH調(diào)成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種物質(zhì)沒(méi)有分開(kāi)。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。

2.6 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=7.00）：乙腈=80：20。

混合對(duì)照?qǐng)D譜：

看到這結(jié)果是不是項(xiàng)目就OK了。但是既然是方法開(kāi)發(fā)，方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是必不可少的，需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件。

結(jié)果問(wèn)題就來(lái)了.....

化合物1圖譜：

化合物1峰型一直分叉，更終發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是色譜柱使用多種離子對(duì)試劑，造成色譜柱改性，新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果。好吧，再開(kāi)始。

然后又是繼續(xù)摸索。不得不說(shuō)有時(shí)候運(yùn)氣也是成功的一部分，在一次流動(dòng)相配置過(guò)程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨，突然我就冒出想法，用四丁基溴化銨試試，不知道結(jié)果會(huì)怎么樣，說(shuō)做就做。

2.7 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20。

混合對(duì)照?qǐng)D譜：

03 結(jié)果

結(jié)果：分離度，峰型都滿(mǎn)足要求，完美。當(dāng)然還是需要重現(xiàn)方法的。

三根新色譜柱重現(xiàn)結(jié)果：

更終色譜條件：

色譜柱：月旭Xtimate^? C18（4.6*250mm，5μm）。

流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20

檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；

柱溫：30℃；

流速：1mL/min；

進(jìn)樣體積：10μL。

搞定交差！

04 實(shí)驗(yàn)小結(jié)

在液相應(yīng)用方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，首先需結(jié)合需要分離的目的，確定思路，一個(gè)方法更初的思路，是決定這個(gè)方法開(kāi)發(fā)的效果，效率的更根本因素；其次是細(xì)節(jié)，任何細(xì)節(jié)都有可能導(dǎo)致你實(shí)驗(yàn)的成功與否；更后是運(yùn)氣，牛頓發(fā)現(xiàn)萬(wàn)有引力還有運(yùn)氣成分呢，說(shuō)不定你是下一個(gè)。

同時(shí)，在一個(gè)方法確定好之后，一定需要使用一根新的色譜柱來(lái)驗(yàn)證，因?yàn)樵诜椒ㄩ_(kāi)發(fā)過(guò)程中，我們會(huì)使用到各種流動(dòng)相條件，會(huì)對(duì)色譜柱一個(gè)改性，特別是使用離子對(duì)試劑的方法，否則后續(xù)的重現(xiàn)性問(wèn)題會(huì)是一個(gè)非常頭痛的事情。